Einleitung
Seit der Entdeckung der DNA wurden mehrere Technologien entwickelt, um die Organismen für bessere landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen genetisch zu manipulieren. Die Sequenzierungstechniken der nächsten Generation haben die Identifizierung der verschiedenen Gene und Mutationen in der DNA erleichtert. Die seit langem verwendeten GVO und Klontechniken sind das direkte Ergebnis der Fortschritte in diesem Bereich. Diese Klontechniken wurden in den letzten Jahrzehnten für eine Vielzahl medizinischer, landwirtschaftlicher, industrieller und Forschungsanwendungen genutzt. Trotz aller Entwicklungen und Fortschritte besteht jedoch ein ständiger Bedarf an fortschrittlicheren Genbearbeitungstechniken, die präzise und genau sind. Der Einsatz programmierbarer Nukleasen für genetische Veränderungen hat im letzten Jahrzehnt aufgrund ihres Potenzials zur Behandlung verschiedener Erbkrankheiten und Krebs zugenommen. Im letzten Jahrzehnt sind drei Hauptklassen programmierbarer Nukleasen ans Licht gekommen – die Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs), die Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektor-Nukleasen (TALENs) und die Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – assoziiertes Cas9 (CRISPR/Cas9). .
Zinkfingernukleasen (ZFNs)
ZFNs waren das am frühesten entwickelte Werkzeug zur Genombearbeitung mit größerer Präzision hinsichtlich ihrer Fähigkeit, den genetischen Inhalt zu verändern. Die ZFNs bestehen aus zwei Domänen, wiederholten Zinkfingerproteinen (ZFPs), deren DNA-Bindungsdomänen mit der unspezifischen DNA-Spaltungsdomäne einer FokI-Restriktionsendonuklease fusioniert sind. ZFNs fungieren als Dimer, wobei jede Monomereinheit über die Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne neun bis 18 Basenpaare (bps) DNA erkennen kann. Es gibt eine breite Palette von Zinkfingerdomänen, die die unterschiedlichen DNA-Tripletts erkennen. Diese können miteinander verbunden werden, um Polydaktyl-Zinkfinger-Proteine zu erzeugen, die auf ein breites Spektrum möglicher DNA-Sequenzen abzielen können. Allerdings sind die Off-Target-Bearbeitung/Mutationen das größte Problem im Zusammenhang mit der ZFNs-basierten Genbearbeitung. Daher gibt es reichlich Möglichkeiten, die Effizienz dieses Prozesses zu steigern.
Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs)
TALENs haben sich als Alternative zu ZFNs für die Genombearbeitung entwickelt. Ähnlich wie die ZFNs bestehen TALENs aus zwei programmierbaren DNA-Bindungsdomänen, die mit einer FokI-Endonukleasedomäne fusioniert sind, und funktionieren durch die Einführung von Doppelstrangbrüchen (DSBs). Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs) werden auf natürliche Weise von Xanthomonas spp. sezerniert. von Bakterien, die sich an die DNA des Wirtsorganismus binden. Die TALE-DNA-Bindungsdomäne besteht aus mehreren Wiederholungen mit 33–35 Aminosäuren, wobei jede Wiederholung ein einzelnes Nukleotid erkennt. Die Spezifität in der TALE-DNA-Bindungsdomäne beruht auf dem Vorhandensein hypervariabler Regionen in jeder Domäne an 12 und 13 Aminosäurepositionen. Daher können die sequenzspezifischen TALENs erzeugt werden, indem diese Aminosäurereste in hypervariablen Regionen modifiziert und die verschiedenen TALE-Wiederholungen miteinander verknüpft werden.
Clustered regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR)–assoziiertes Cas9 (CRISPR/Cas9)
Neben ZFNs und TALENs ist CRISPR/Cas9 ein weiteres schnell aufkommendes Werkzeug zur Genbearbeitung. Es handelt sich um ein natürlich vorkommendes Bakteriensystem, das als Bestandteil der bakteriellen adaptiven Immunität fungiert. Es schützt Bakterien vor eindringenden Viren und Plasmiden durch RNA-gesteuerte DNA-Spaltung durch das Cas-Protein. Es gibt drei Hauptkomponenten des CRISPR/Cas9-Systems – die CRISPR-RNA (crRNA), die transaktivierende crRNA (tracrRNA) und das Cas9-Enzym. Die crRNA wird vom eindringenden System transkribiert und ist als Protospacer-Sequenz bekannt. Sie hybridisiert mit der tracrRNA, die die Bindung der Cas9-Nuklease an die DNA-Spaltungsstelle auslöst und als Basis dafür fungiert. Im Gegensatz zu ZFNs- und TALENs-Systemen, die die spezifischen Sequenzen in der gegebenen Genomsequenz mithilfe verschiedener Erkennungsproteine erkennen, verwendet das CRISPR/Cas-System die RNA-Sequenz, die zur genomischen Zielsequenz komplementär ist. Der Vorteil der RNA-Hybridisierung bei der ortsspezifischen Spaltung führt zur Verwendung chimärer „Leit“-RNA (gRNA) für die genomische Bearbeitung, die durch die Fusion von crRNA und tracrRNA entsteht. Die gRNA enthält 20 Nukleotid-Leitsequenzen, die für die Bindung an spezifische DNA-Sequenzen konzipiert sind. Daher sind gRNA und Cas9 in der Lage, die entsprechende Stelle zu scannen und daran zu binden, um ortsspezifische Doppelstrangbrüche (DSB) zu erzeugen. Somit bietet das CRISPR/Cas9-System im Vergleich zu den vorherigen Techniken eine relativ genauere Technik der Genbearbeitung und kann für ein breites Anwendungsspektrum eingesetzt werden.
Zusammenfassung
Bisher zeigt sich, dass die aktuellen Gen-Editierungsmechanismen präziser sind und ein breites Anwendungsspektrum haben, ohne größere ethische und physiologische Implikationen zu haben. Daher sind größere finanzielle Vorteile und kontinuierliche Verbesserungen in diesem Bereich unumgänglich. Darüber hinaus sind rationelle Forschung und Entwicklung, ordnungsgemäße Zielidentifizierungen und der Schutz geistigen Eigentums von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Therapeutika, biologischen Produkten und Verfahren der nächsten Generation.
